chip实验原理及步骤

chip实验原理及步骤

chip实验原理

在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学来自方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的D360问答NA片段，通过对目八组汉温的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

chip实验步骤具体如下：

第一天：

(一)、细胞的甲醛交联能散研谓击盟食掉味型房与超声破碎。

1、毕盯掘取出 1 平皿细胞( 10cm 平皿)，加入 243ul 37 %甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%。(培养基共有 9ml )

2、37 摄氏度孵育 10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M 。450ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5min 即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。

5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管巴创喜油众据中(PBS 依次为 5ml ，3ml 和 3ml )。预冷后 2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysi季称s Buffer 。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管 加 入 400ul SDS Lysis Buffer 。将 手核2 管混在一起，共 800ul 。

7、超声破碎： VCX750 ， 25%功率， 4.5S 冲击， 9S 间隙。共 14 次。当然，如果实验室有Bioruptor 这种神器的话那就轻松了。

(二)、除杂及抗体哺育。则睁

8、超声破碎结束后， 10， 000g 4 度离心 10min 。去除不溶物质。在金留取 300ul 做实验，其余言看办专价六绿织保存于-80 度。300ul 中， 100ul 加抗体做为实验组; 100ul 不加抗体做为对照组搞还而动次胞论范气振; 100ul 加 入 4想美置越ul 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M )， 65 度处理 3h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效换杂护果。

9、在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ul ChI成理装学集入P Dilution Buf绝西给杂米阿准fer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入 60ul Protein A Aga矛次香斗rose/Sal础mon Sperm DNA 。4 度颠转混匀 1h。

10、 1h 后，在 4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min 。

11过该兵积皮略课时、取上清。各留取 20ul 做为 input 。一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。 4 度吧华根船粉得服热挥颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul 5M NaCl ， 65 度处理 2h 解交联。分出一半用酚 /氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转 2h。

13、 4 度静置 10min 后， 700rpm 离心 1min 。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转 10min ，4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min ，除去上清。

洗涤溶液： a. low salt wash buffer----one wash

b. high salt wash buffer-----one wash

c. LiCl wash buffer------one wash

d. TE buffer------two wash

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方： 100ul 10 % SDS， 100ul 1M NaHCO3 ， 800ul ddH2O ，共 1ml 。每管加入 250ul 洗脱 buffer ，室温下颠转 15min ，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。终的洗脱液为每管 500ul 。

16、解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl (NaCl 终 浓 度为 0.2M )。混匀，65 度解交联过夜。

第三天：

(一)、DNA 样品的回收

17、解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA ( MBI )， 37 度孵育 1h。

18、每管加入 10ul 0.5M EDTA ， 20ul 1M ***.hcl ( PH 6.5)， 2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2h。

19、 DNA 片段的回收 ――― omega胶回收试剂盒。终的样品溶于 100ul ddH2O 。

(二)、PCR 分析

ChIP 技术总结

(一)关于细胞

细胞的生长状态要好。 因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络， 也很有

可能影响你所研究的 TF 与其靶 Promoter 的结合。一般细胞长到 75%- 80%比较好。

(二)关于抗体

抗体是实验成败的致命因素之一!必须是 IP 级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和 santa cruz 的抗体，即使是 IP 级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。 两种抗体各有利弊。 单抗特异性强，背景低。 但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭， 导致单抗不能识别靶蛋白。 多抗虽然没有这个问题， 但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域) ，选择多抗比较稳妥一些。

(三)关于交联与超声破碎

这一块的确是 ChIP 实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其 Promoter 相结合，富集得到的 Promoter 的量不高，实验假阴性。 交联过充分， 基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

一般来讲，按照经验，交联条件取决于细胞类型。 不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如： NIH - 3T3 的交联条件是室温( 25 摄氏度)下 15min ， 1%的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor 这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp- 1000bp。但是 200bp- 2000bp 的范围也是可以接受的。

(四)关于操作

希望尽可能的保持低温( 4 度)。沉淀的时候可以先在 4 度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速( 500rpm 等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说 ChIP 实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到 PCR 结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

(五)关于解交联

虽然说明书上说 4 小时已经足够， 但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA 不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在 EP 管口封上封口膜。

(六)关于 DNA 片段的回收

需要注意的是：样品中 SDS 样品较高，普通的 PCR 产物回收试剂盒回收，很有可能会在终的样品中混入 SDS，影响 PCR 实验结果。小 Tip ：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除 SDS 沉淀。